免疫透射比浊法测定血清rbp的方法学及临床价值初步评价

time:2011-06-19 20:19:38

免疫透射比浊法测定血清rbp的方法学及临床价值初步评价
摘要:目的 对兔疫透射比浊法测定血清视黄醇结合蛋自(rbp)进行方法学和临床应用评价。方法 用兔疫透射比浊法测定62例肾病患者(肾小球肾炎35例、糖尿病肾病14例、慢性肾功能衰竭13例)、86例肝病患者(急性肝炎21例、肝硬化49例、肝恶性肿瘤16例)及100名健康体检者的血清rbp含量,根据关国临床实验室标准化委员会(nccls)相关文件对其进行精密度、线性、准确度等方法学评价以及临床应用初探。结果 兔疫透射比浊法的批内变异系数(cv)为2.05%~4.3%,批间cv为2. 94%一5 41%,总c v为2 .7%一8. 85%线性不低于120 m g /i,回归方程为y= 0 934x+ 4 .83 ,r=0 975。最低检测浓度为1 mg/l。低、中、高浓度回收率分别为109.5%、96.2%,98.8%总回收率为99 4%。该法与dade behrng特种蛋白仪的相关性良好(r=0 997) 肾病各组的血清rbp含量均高于健康对照组(p均<0 01),但肾病组内差异均无统计学意义(p>0.05)肝病各组的血清rbp含量均低于健康对照组(p均<0.01)。肝病组内比较差异均无统计学意义(p>0.05)。结论兔疫透射比浊法简便、快速、灵敏、结果准确,可用全自动生化分析仪测试,宜于推广。rbp对肝、肾疾病的诊断都有临床意义。
         关键词:视黄醇结合蛋自;兔疫透射比浊法;肝病;肾病
         evahiation on clinical application and m ethodology of serun rbp levels by inmune turbidetry wang yongqqing, x ia huay yao min (department of clinicsl laboratory, haikou people’s hodpital ,hinan haikou 570208, china)
abstract:objective  to evaluate c;linical application and methodology of seluln retinol-binding protein(rbp)levels by inmune turbirlimetly methods a total of 62 patients w ith nephropathy(35 glnnelular nephritis case, 14 diabetlc nephropathy cases and 13 chlronicirenal failure cases),   and 100 healthy subjects were enrolled.serum rbp levels were determined by immune turbidimetru . according to national committee for clinical laboratory standards(nccls) documents ,the precision ,linearity ,accuracy and clinical application were evaluated. results the within-run coefficient of variation (cv)was 2.05%-4.35%,and the between-run cv was 2,94%-5.41%.the total   cv was2.71%-8.85%.the linearity was ≥120mg/l ,and the regression equation was y=0.934x+4.828(r=0.975). the minimum detection level was 1mg/l. the low ,middle and high recoveries were 109.5%,96.2%and 98.8%. the total recovery was 99.4%.the method and the special protein analyzer of dade behring were correlated well (r=0.997). the serum rbp levels of nephropathy patients were all higher than those of heslthy controls (p<0.01).the serum rbp levels had no statistical significance between the 3 kinds of nephropathy patients (p<0.05)。the serum rbp levels of liver disease patients were all lower than those of healthy controls (p<0.01).conclusins  immune turbidimetry is simple ,rapid ,sensitve and accurate ,and rbp can be tested by automatic biochemical analyzer .it is suitable for clinical laboratory application. rbp has aclinical significance for liver and kidney disease diagnosis .
         key words :retinol-binding protein; immune turbidimetry ; liver disease; kidney disease.
 
视黄醇结合蛋白(retinol binding protieon,rbp) 1961年由b ergganl在a2-球蛋白区域发现的,称为长a2-球蛋白〔1〕1968年由kanai等分离提纯〔2〕根据结构、功能不同分为单纯视黄醇结合蛋白(rbp) ,细胞视黄醇结合蛋白(crbp) ,细胞视黄酸结合蛋白(crabp)及细胞视黄醛结合蛋白(craibp)等。rbp由肝细胞粗面内质网合成,90%与视黄醇结合,称为holo-rbp,其余的称为apo-rbp. rbp广泛分布于人体血清、脑脊液、尿液及其他体液中。在血液中,rbp与视黄醇、前白蛋白以1: 1: 1(mol)的复合物形式存在,转运体内90%的视黄醇至机体组织。游离的rbp从肾小球滤出,其中绝大部分被近端肾小管上皮细胞重吸收,并被分解,仅有少量从尿中排出。血、尿中rbp浓度改变能够敏感地反映近端肾小管功能、肝功能损害程度〔3-6〕。目前测定血、尿中的rbp方法较多,有放射免疫扩散、免疫浊〔7〕免疫电泳、酶联免疫吸附和放射免疫分析。免疫透射比浊法则因易于自动化分析而拥有更为
广泛应用的应用前景。
材料和方法
一、实验对象
1.对照组 海口市人民医院健康体检者100例,年龄21~78岁,其中男45名,女55名。经b超、心电图和临床各项检查无肝病、肾病、冠心病、肿瘤、糖尿病等病史和疾病。
2.病例组  收集海口市人民医院2009年11月1日至2010年3月31日肾内科、消化内科、内分泌科的住院患者和门诊患者。按照第2届全国肾脏病学术会议的肾脏疾病的临床分类法将肾病组(62例)分为肾小球肾炎35例、糖尿病肾病14例、慢性肾功能衰竭13例。按照肝脏疾病的病变程度将肝病组(86例)分为急性肝炎21例、肝硬化49例、肝恶性肿瘤16例。
二、仪器和试剂
hitachi  7600全自动生化分析仪,rbp试剂由乐橙官网提供,校准品由dade behrilvg公司提供(批号:083685a );白蛋白(a ib)、丙氨酸氨基转移酶(alt)、碱性磷酸酶(alp)、x ;}-氨酞基转移酶( ggt )试剂由伊利康生化试剂有限公司提供(批号分别为090812, 090614, 090718, 090815 ) 。dade behr 1lvg特种蛋白仪,rbp原厂配套试剂
批号为df8106798) ,缓冲液buf'f-erl (批号为df501271)、稀释液diluentl(批号为df304162)
及校标液ca l 1(批号为df409437)。
三、方法
1.rbp测定 在hiitachi 7600全自动生化分析仪上采用免疫透射比浊法(二点终点法)测定。待测血清4ui,加试剂1 ( r 1) 240 ul后,37℃孵育16个循环,读测第1点吸光度(a1 )值,加入试剂2( r2) 60 ui, 37孵育至31个循环,读测第2点a值(a2)}待测血清a =a2一a1待测样本rbp浓度(mg/l)=[样本a值(a 2一a1)/校准品a值(a2-a1)*rbp校准浓(m g /l)。dade  behrilvg特种蛋白仪rbp项目按说明书操作。
2.其他项目alb 采用终点法,alt、alp、ggt均为酶速率法ggt均为酶速率法。四、四、方法学评价
1.空白试验 用生理盐水作为样本,按照测定方法重复测定3次,取平均a值。
2.线性根据美国临床实验室标准化委员会(nccls) ep6-p文件,取1份rbp为120 m g /l的标准品做一定倍数稀释,分别取20,40,60,80,120 mg/l  5个不同浓度的样本,连续测定2次取平均值。
3.精密度根据(nccls )eps -6文件,取高(68.0 m g /l)、低(30.1 m g /l) 2个浓度的rbp血清样本,分别测定20次,连续测定20 d。
4.最低检测浓度以r1代替r2(抗体),用新鲜混合血清重复测定20次,用x±2s计算最低检测浓度。
5.回收实验 取一份新鲜血清,分别加入等量42,104,160 mg/l 3个浓度的标准品(厂家提供),做回收实验。
6参考范围 选择正常健康体检成年人100名、新生儿33名,0~17周岁健康人群115名(按0~1,2~3,4~5、6~7,8~9, 10~11、12~13,14~15,16 ~17年龄段分组)。
7.特异性 验证rbp抗体与a,-微球蛋白、β2微球蛋白、转铁蛋白有无交义反应。
8干扰试验 取1份血清rbp为56 mg/l的样本,加入不同浓度三酞甘油(tg)、总胆红素( tb i1)和血红蛋白(h b),测定有无干扰。
9.比对试验随机取日常检测的血清样本30份(包含低、中、高值),分别用由上海北加rbp试剂盒和h itach i 7600全自动生化分析仪组成的检测系统与dade behrilvg特种蛋白仪rbp检测项目作比对。计算相关系数(r),进行配对t检验。
五、统计学方法
采用m icrosoft exce12009和spss13 0进行数据统计分析。数据采用x士s、表示,显著性检验用方差分析。
结果
一、方法学评价
1.空白试验空白a值≤0.05。
2线性 线性回归方程为y = 0 934 x+4 83,r= 0 975。当试剂与样本比率为75: 1时
线性不低于120 mg/l。
3精密度 低值( 30. 1 mg/l)批内变异系数(cv)为4.35%、批间cv为5.41%,总cv为8.85%;高值( 68 .0mg/l)批内cv为2.05%批间cv为2 94%,总cv为2 71%。
4最低检测浓度 计算得出免疫透射比浊法测定rbp的最低检测浓度为1 mg/l。
5回收实验42,104,160 m g/l  3个浓度的标准品的回收率分别为109.5%、96.2%98.8%
总回收率为99. 4%。
6参考范围 正常成年人无年龄、性别差异,16周岁以上少年rbp水平接近正常成年人。
结果见表1
 
 
7.特异性 经实验,rbp抗体与a,-微球蛋白、β2-微球蛋白转铁蛋白无交义反应。
8干扰试验tg<6 4 mmol/l,hb< 4 0 g/l、tbii< 160umol/l时对本方法测定rbp无明显干扰。见表2
 
 
 
9.比对试验该法与dade behrilng特种蛋白仪rbp项目比较,回归方程为y= 1. 012x -0.038   r= 0 997, t= 1.782,p >,0.05两者比较差异无统计学意义。
九、临床应用
1.肾病肾小球肾炎、慢性肾功能衰竭和糖尿病肾病患者(排除同时患有肝病的患者)血清rbp水平均高于正常对照组(p <0.01),而3种肾病组问差异无统计学意义(p >0.05)。
见表3
 
 
2肝病急性肝炎、肝硬化、肝恶性肿瘤患者(排除同时患有肾病的患者)血清rbp水平均低于正常对照组(p <0.01,而3种肝病组间血清rbp无差异(p > 0.05)。见表3
3肾病患者血清rbp不升高原因分析 分析54例血清rbp< 76 11 mg/i,而半肤氨酸蛋白酶抑制剂c(csy c)和其他肾功能指标升高的肾炎和肾功能衰竭患者肝功能结果,有90.74%的患者白蛋白[(27. 67士6 38) g/l]低于正常参考范围,而a lt等指标升高者只占12 9%同时分析同期49例血清rbp< 76 .11 mg/i,而c sy c和其他肾功能指标升高的糖尿病肾病患者肝功能结果,白蛋白[(30.95士4 .44) g/l]降低并不明显,但有71.4%患者氨基转移酶、碱性磷酸酶或转肤酶指标升高,可见糖尿病肾病患者rbp不升高主要由肝脏功能
异常引起。
见表4
 
讨论
目前,测定血清rbp的方法很多,有放射免疫扩散、免疫比浊、免疫电泳、酶联免疫吸附和放射免疫分析等。免疫透射比浊法操作简单、仪器设备要求不高、没有环保和操作人员自身防护等问题,空白试验、线性、精密度、特异性、最低检测浓度和回收实验等都能满足临床要求。该法简便快速、灵敏高、适用于全自动生化分析仪,临床上易于推广。
临床应用方面,本研究分别选取了肝功能异常和肾功能异常的患者对其进行临床应用的初步探讨。结果发现在肝功能正常的情况下,当肾小球率过滤降低时,rbp排泄减少,血清中rbp的蓄积,导致血清rbp含量不同程度的升高。在肝病组,当肝功能异常时,产生的rbp的量减少,血清rbp的含量下降,结果见表3
通过对肾病患者血清rbp不升高原因分析,本研究发现肾炎和肾功能衰竭患者血清rbp不升高主要是肾小球滤过膜通透性升高引起,说明随着肾病进一步发展,血清rbp不升反降;而糖尿病肾病患者血清rbp不升高的主要原因是肝脏功能异常。
 由上可知,血清rbp检测对肾病和肝病都是一个非常好的指标,相对于尿酸、尿素、肌配、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、白蛋白等单项指标来说,其升高和减低都具有临床意义,但在肾病发展过程中血清rbp在不同
阶段有不同的变化〔7〕,同时还会受肝功能的影响,这一点在分析时必须引起足够的注意。免疫透射比浊法测定血清rbp是一种较为灵敏和特异的指标,操作方便,适用于各类自动化生化分析仪。如将血清rbp的检测与其他指标联合测定,相信对于疾病的临床诊断将更为有效。
参考文献
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